近日，我?；瘜W學院楊榮華教授和卿志和副教授在細胞內(nèi)信號放大成像分析方面取得重要進展，相關(guān)研究成果“Intramolecular catalytic hairpin assembly on DNA tetrahedron for mRNA imaging in living cells: improving reaction kinetics and signal stability”于2019年12月18日在線發(fā)表于英國皇家化學會（RSC）《Chemical Science》雜志: Chem. Sci., 2020, DOI: 10.1039/C9SC04916A.
細胞是組成生命體的基本單元，細胞內(nèi)生化物質(zhì)（核酸、蛋白質(zhì)、活性小分子）的表達失調(diào)往往與疾病密切相關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)性疾病、糖尿病等重大疾病。準確獲取細胞成分信息是研究細胞生命狀態(tài)、活動功能和病理變化的關(guān)鍵，而發(fā)展有效的分析檢測技術(shù)是實現(xiàn)生化信息準確獲取的基礎(chǔ)。一些重要細胞成分通常含量低（nM水平或更低），難以通過常規(guī)的方法進行檢測，信號放大技術(shù)顯得尤為重要，例如針對核酸信號放大的PCR等酶促放大技術(shù)。PCR等酶促放大技術(shù)為低豐度標記物檢測提供了重要手段，但往往依賴于熱循環(huán)過程、蛋白酶的使用、精密控溫裝置等條件，將放大反應(yīng)局限于緩沖液、細胞裂解液或死細胞。生命物質(zhì)處于動態(tài)變化中，細胞生命狀態(tài)的變化會導致細胞成分含量、構(gòu)型、活性的變化。所以，離體的分析技術(shù)難以反映最真實的生命狀態(tài)，發(fā)展細胞內(nèi)信號放大技術(shù)尤為重要。
基于DNA動態(tài)自組裝的免酶等溫放大技術(shù)（Dynamic DNA Self-Assembly, DDSA）為實現(xiàn)細胞內(nèi)原位信號放大、活細胞狀態(tài)獲取信息提供可能，并且多種相關(guān)方法已在國際權(quán)威期刊被報道。但是，我們發(fā)現(xiàn)，用于細胞內(nèi)放大檢測的DDSA方法的反應(yīng)過程主要依賴游離探針分子間的反應(yīng)，這樣反應(yīng)速度慢，尤其在低探針濃度下，分析時間長（free catalytic hairpin assembly，free-CHA）；另外，反應(yīng)產(chǎn)物往往呈分子狀態(tài)，容易受到酶切等生物干擾。如何提高反應(yīng)動力學和成像信號穩(wěn)定性是活細胞信號放大技術(shù)所面臨的挑戰(zhàn)之一。
為了解決面臨的挑戰(zhàn)，在前期研究的基礎(chǔ)上（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 11574-11585; Anal. Chem. 2016, 88, 9285-9292; Anal. Chem. 2014, 86, 4934-4939; Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 3036-3055; ACS nano 2013, 7, 6545-6554），長沙理工大學化學與食品工程學院楊榮華教授課題組基于限域效應(yīng)和DNA四面體納米結(jié)構(gòu)及抗酶切優(yōu)勢，設(shè)計和構(gòu)建了分子內(nèi)自組裝技術(shù)用于提高放大反應(yīng)動力學，并提高信號穩(wěn)定性（intramolecular catalytic hairpin assembly，intra-CHA，如圖1所示）。該工作以腫瘤分子標記物MnSOD mRNA為分析對象，設(shè)計和編碼核酸探針，通過理論推算和實驗驗證，結(jié)果表明，兩探針之間的距離明顯縮小，局部濃度得到顯著性提升，反應(yīng)初速度提高15.6倍，同時，相比于free-CHA，intra-CHA的信號穩(wěn)定性得到明顯提升，有促于細胞內(nèi)信息的準確獲取。通過識別單元序列的調(diào)整，intra-CHA可適用于細胞內(nèi)多種物質(zhì)的信息獲取。
圖1：(b) 根據(jù)碰撞效率理論，intra-CHA和free-CHA探針理化參數(shù)的推算；(b) intra-CHA探針對細胞內(nèi)mRNA的原位信號放大成像過程示意圖.
圖2：(a) 不同CHA體系下的實時熒光監(jiān)測；(b)不同CHA產(chǎn)物抗酶切過程的電泳標準。
圖3：不同CHA產(chǎn)物在活細胞內(nèi)的信號變化，intra-CHA具有更好的信號穩(wěn)定性。
該項工作實驗部分主要由化學與食品工程學院碩士研究生胡金蕾、許景遠完成。研究工作得到了國家自然科學基金、湖南省自然科學基金等項目的支持。全文鏈接：
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/sc/c9sc04916a#!divAbstract。
（文\林朝暉 圖\卿志和）
